Teilprojekt P15 

Mehrdimensionale EPR-Spektroskopie an proteingebundenen redoxaktiven paramagnetischen Zentren

Ziel dieses Teilprojektes ist es, die funktionelle Rolle von paramagnetischen Zentren bei Elektronentransfer- (ET) und katalytischen Reaktionen in Proteinkomplexen zu untersuchen und zu beschreiben. EPR-Spektroskopie ist eine hervorragend geeignete Methode, um diese Zentren und ihre lokale Proteinumgebung zu charakterisieren. Die paramagnetischen Zentren können dabei EPR-spektroskopisch in drei Klassen unterteilt werden: organische Radikale, Übergangsmetallionen und Eisenkomplexe.

Transiente organische Radikale (wie beispielsweise Chinone, Chlorophylle, Tyrosine) sind meist kurzlebige Zwischenprodukte in ET-Reaktionen und liegen demnach unter Gleichgewichtsbedingungen in Proteinen oft in zu geringen Konzentrationen vor, um mittels EPR direkt detektiert zu werden. Durch zeitaufgelöste Puls-EPR-Messungen, schnelles Einfrieren nach Reaktionsbeginn (freeze-quench) oder durch Änderung der Redoxbedingungen können diese Radikale beobachtet werden. Zur Unterscheidung und genauen Charakterisierung dieser Radikale und ihrer Bindungseigenschaften sind Hochfeld-EPR- (B > 3T), ENDOR- (Electron Nuclear  Double  Resonance) und Puls-EPR-Methoden notwendig. In vielen Fällen besitzen diese Moleküle lange Relaxationszeiten, so dass 1- und 2-dimensionale Puls-EPR-Methoden, wie ESEEM (Electron Spin Echo Envelope Modulation), HYSCORE (HYperfine Sublevel CORrElation spectroscopy) und PELDOR (Pulsed ELectron DOuble Resonance) sehr erfolgreich eingesetzt werden können, um die Proteinumgebung zu untersuchen.

Proteingebundene Übergangsmetalle (wie beispielsweise Mn, Cu, Mo), die entweder strukturelle Bedeutung haben oder häufig an ET- und katalytischen Redoxreaktionen beteiligt sind, können in ihren paramagnetischen Zuständen mittels EPR-Spektroskopie untersucht werden. Die erhaltenen Spektren sind meist sehr komplex und enthalten neben den Hyperfeinkopplungen zu den Liganden (und eventuell des Metalls selbst) Informationen über die Spin-Bahn-Kopplung, den Ladungstransfer-Charakter, die Ligandenfelder sowie die Kovalenz der Ligandenbindungen, die sich im anisotropen G-Tensor niederschlagen. Um diese unterschiedlichen Effekte zu trennen, sind Multifrequenz-EPR-Messungen besonders wichtig, da die verschiedenen Beiträge sich durch ihre Abhängigkeit vom externen Magnetfeld unterscheiden. Im Gegensatz zu organischen Radikalen können an diesen Übergangsmetallionen bereits bei Standardmagnetfeldern von 0,3 T (X-Band-EPR) orientierungsselektive Messungen an ungeordneten Proteinproben durchgeführt werden, falls die oft kürzeren Relaxationszeiten dies zulassen. Dadurch können strukturelle Informationen (Abstände und Winkel) getrennt bestimmt werden.

Die Eisenkomplexe (wie beispielsweise Eisen-Schwefel-Verbindungen FeS und Häm-Gruppen) bilden EPR-spektroskopisch eine besondere Klasse paramagnetischer Zentren in Proteinen. Sie zeichnen sich durch sehr kurze Relaxationszeiten aus, so dass sie erst bei tiefen Temperaturen (<60 K) zu beobachten sind. Hyperfein-Wechselwirkungen zu den Atomkernen sind selten im cw-EPR-Spektrum aufgelöst, können aber durch Puls-EPR bei sehr tiefen Temperaturen (T<5 K) gemessen werden. Die schnelle Relaxation dieser Komplexe kann jedoch benutzt werden, um strukturelle Information über paramagnetische Zentren der beiden anderen erwähnten Gruppen zu erhalten (bis zu einem Abstand von 1-3 nm). Da diese Komplexe oft Teil von ET-Ketten in Membranproteinen sind, ist diese Situation häufig gegeben. In diesen Fällen wird das Relaxationsverhalten der langsamer relaxierenden paramagnetischen Zentren durch die benachbarten Eisenkomplexe beeinflusst. Puls-EPR-Messungen der Relaxationsraten bei unterschiedlichen Temperaturen können dann Abstand und relative Orientierung der beiden paramagnetischen Moleküle im Protein liefern.

In unserer Arbeitsgruppe stehen Puls- und cw-EPR-Spektrometer bei 0,1 T (3 GHz, S-Band), 0,3 T (9 GHz, X-Band) und bei 6,4 T (180 GHz, G-Band) zur Verfügung. Das gepulste S-Band- und das weltweit höchstfrequente gepulste G-Band-Spektrometer wurden in der Arbeitsgruppe entwickelt. Cw- und Puls-ENDOR-Experimente können im X-Band durchgeführt werden, PELDOR-Methoden wurden ebenfalls in der Arbeitsgruppe im S-Band und im X-Band entwickelt und erprobt. Vor allem eine Kombination dieser spezialisierten EPR-Methoden mit Informationen aus Röntgenstrukturdaten oder anderen spektroskopischen Techniken erlauben eine detaillierte Beschreibung der paramagnetischen Zentren und ihrer Funktion. Ein Paradebeispiel für solch eine synergetische und weitreichende Zusammenarbeit sind die Photosysteme I und II sowie photosynthetische Reaktionszentren aus Bakterien.

Folgende Proteinkomplexe sollen in der neuen Periode mit Hilfe dieser Methoden

untersucht werden:

1. Komplex I (NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase): Charakterisierung der FeS-Zentren N1 und N2 mittels ESEEM (HYSCORE) an Wildtyp und Mutanten (Kooperation mit Teilprojekt P2 Brandt)

2. Komplex III (Ubichinol-Cytochrom-c-Reduktase; bc₁-Komplex): Beschreibung der Bindungssituation von Q_i (Kooperation mit Teilprojekt P17 Hunte)

3. Komplex IV (Cytochrom-c-Oxidase bzw. Chinol-Oxidase):Charakterisierung der Bindung (Abstand und Geometrie) von Cytochrom c an die Cytochrom-c-Oxidase durch cw-EPR, Relaxationsmessungen und PELDOR; Charakterisierung und Lokalisierung des Tyrosin-Radikals durch Untersuchung von gezielten Tyrosin-Mutationen und Vergleich mit anderen Organismen; Charakterisierung der Proteinbindung des Semichinon-Radikals an durch Mutagenese modifizierten Bindungstaschen in der Chinol-Oxidase (aus E. coli) mittels ESEEM bzw. HYSCORE; Wechselwirkung des Chinons mit dem nächsten Häm-Zentrum durch Hochfeld-Puls-EPR und PELDOR (Kooperationen mit den Teilprojekten P8 Ludwig , P9 Michel und P24 Hellwig/Mäntele)

4. Polysulfid-Reduktase aus Wolinella succinogenes:Bestätigung der direkten Substratbindung an den Molybdän(V)-Übergangszustand; Dichte Funktional Theorie (DFT)-Rechnungen zu den Strukturen der EPR-spektroskopisch charakterisierten Mo(V)-Zustände; Bestimmung des Abstandes zum nächsten FeS-Cluster mittels Relaxations- und PELDOR-Messungen (Kooperation mit dem Teilprojekt P6 Kröger/Klimmek und Prof. Kaupp, Univ. Würzburg)

5. Photosystem II:Bestimmung der Lage der Elektronendonor-Moleküle (Chlorophyll_Z und Carotinoid) in unterschiedlichen PS II-Präparationen durch PELDOR (in Kooperation mit dem neuen Teilprojekt Büchel P28 und Prof. Rutherford, CEA Saclay)

Die Punkte 1.  3. und 4. sind dabei Weiterführungen von bisher bereits erfolgreich durchgeführten Untersuchungen zur lokalen Charakterisierung der paramagnetischen Zentren in den Proteinkomplexen mittels ESEEM und ENDOR.

Neu sollen in dieser Periode gepulste Elektron-Doppelresonanz-Messungen (PELDOR) zur Abstandsbestimmung zwischen den einzelnen paramagnetischen Zentren in den jeweiligen Proteinkomplexen durchgeführt werden (Punkte 2., 3., 4. und 5.).

geändert am 16. September 2007  E-Mail: Webmastermacmillan@chemie.uni-frankfurt.de