Teilprojekt  P9

Strukturelle und mechanistische Untersuchungen an terminalen Oxidasen und Optimierung von Methoden der Membranproteinkristallisation

Ziel des Teilprojekts ist weiterhin das Verständnis der Funktion und der Wirkungsweise der aeroben terminalen Oxidasen (Cytochrom c Oxidasen, Chinoloxidasen). Diese verwenden Elektronen von Cytochrom c oder Chinolen zur Synthese von Wasser. Dabei werden ein Sauerstoffmolekül und vier Protonen verbraucht und weitere vier Protonen über die bakterielle, bzw. mitochondriale Membran gepumpt. Ausgehend von der im Teilprojekt ermittelten Struktur der Cytochrom c Oxidase von Paracoccus denitrificans und einer Analyse der existierenden Literatur haben wir zunächst die allgemein akzeptierte These, dass das Pumpen von Protonen ausschließlich an den dritten (P -->F Übergang) und vierten Elektronentransfer (F-->O Übergang) gekoppelt sei, angezweifelt, sowie postuliert (und inzwischen mit Teilprojekt P16, Fendler, nachgewiesen), dass Protonen bereits bei in den vorhergehenden Phasen gepumpt werden. Zentrales Anliegen des Teilprojekts ist die weitere Überprüfung eines eigenen mechanistischen Modells des katalytischen Zyklus und seiner Kopplung an das Pumpen von Protonen. Hierzu sollen zusätzliche, definierte und katalytisch relevante Zwischenzustände des katalytischen Zyklus eingestellt und das Enzym mit Hilfe lichtaktivierbarer artifizieller Elektronendonoren weiter reduziert werden. Zusammen mit Teilprojekt P16 (Fendler) sollen dabei entstehende Photopotentiale  gemessen werden. Der Schwerpunkt liegt jetzt beim P-->F Übergang und bei der Untersuchung defekter Enzymvarianten. Die Protonenfreisetzung, bzw. –aufnahme soll an durch gezielte Mutagenese und nachfolgende kovalente Modifizierung mit pH-Indikatoren gewonnene Enzymvarianten zeitaufgelöst untersucht werden. Nach Behandlung mit H₂O₂ entstehende Tyrosinradikale sollen weiter charakterisiert werden (mit Teilprojekt P15, Prisner/MacMillan). Begleitet werden die Experimente von Molekulardynamiksimulationen (mit Teilprojekt P23, Helms) und weiteren elektrostatischen Rechnungen (mit Teilprojekt P19, Lancaster).

Neu begonnen werden soll die Kristallisation und Strukturaufklärung der Chinoloxidase des Archaebakteriums Acidianus ambivalens und von Chinoloxidasen vom Cytochrom bd –Typ. Letztere gehören nicht  zur Superfamilie der terminalen Oxidasen mit einem Häm-Kupfer-Zentrum. Hierzu sollen auch Antikörperfragmente aus phage-display-Bibliotheken eingesetzt werden. Methoden zur Selektion von Phagen mit Antikörperfragmenten, welche spezifisch an solubilisierte, intakte Membranproteine binden, müssen hierzu etabliert werden (mit Teilprojekt P17, Hunte).

Prof. Dr. Hartmut Michel
Max-Planck-Institut für Biophysik
Abteilung Molekulare Membranbiologie 
Max-von-Laue-Str.3
D-60438 Frankfurt am Main
Germany
Tel: +49-69-63031000
Faxl: +49-69-63031002
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geändert am 14. April 2005  E-Mail: Webmastermacmillan@chemie.uni-frankfurt.de